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ELISA試劑盒常見問題及預(yù)防措施

酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)是指將可溶性的抗原或抗體結(jié)合到固相載體上,利用抗原抗體結(jié)合專一性進(jìn)行免疫反應(yīng)的定性和定量檢測(cè)方法。

但在實(shí)際操作及分析中,總會(huì)出現(xiàn)各種問題,本次就ELISA常見問題分析匯總,希望對(duì)科研君的實(shí)驗(yàn)有所幫助。

問題1:高背景/非特異性顯色

結(jié)果描述 可能的原因 建議或預(yù)防措施
終止后,整板結(jié)果顯現(xiàn)均一的黃色或淡黃色;或標(biāo)曲有線性但背景過高 整板發(fā)黃現(xiàn)象可能是錯(cuò)加其他試劑造成 實(shí)驗(yàn)前檢查試劑的組份及批號(hào),確認(rèn)所有組份均屬于對(duì)應(yīng)的試劑盒。不同試劑盒或不同批號(hào)的試劑不能混用。
未充分清洗酶標(biāo)板 確保清洗過程中每個(gè)微孔所加入洗滌液量一致。清洗完成后,將酶標(biāo)板倒扣在吸水紙上輕拍幾下,以除去殘余的緩沖液。
孵育時(shí)間過長(zhǎng) 嚴(yán)格按照說明書操作。
酶標(biāo)記物污染了吸頭及盛放顯色劑容器,或陽性對(duì)照污染了微孔 吸取不同的試劑時(shí)應(yīng)更換吸頭,配置不同的試劑組份時(shí),應(yīng)使用不同的儲(chǔ)液器皿。操作時(shí)請(qǐng)使用移液器。
檢測(cè)抗體或Avidin-HRP的濃度過高 檢查濃度計(jì)算是否正確或進(jìn)一步稀釋后再使用。
底物在使用前曝光或污染 加入底物前,應(yīng)始終避光保存。
顯色時(shí)間過長(zhǎng) 嚴(yán)格按照說明書顯色時(shí)間操作。
讀取吸光值時(shí)使用了錯(cuò)誤的濾光片 TMB為底物時(shí)應(yīng)在450nm波長(zhǎng)讀取吸光值,并以540nm或570nm作為校正波長(zhǎng)。

問題2:白板

結(jié)果描述 可能的原因 建議或預(yù)防措施
顯色步驟結(jié)束后,酶標(biāo)板所有孔均無顏色;陽性對(duì)照不顯色 組份試劑混淆使用 配制或使用時(shí)應(yīng)看清楚標(biāo)簽。
洗板及加樣過程中,酶標(biāo)物受污染失活失去催化顯色劑顯色的能力 確認(rèn)配制洗液的容器已洗干凈、無污染。
遺漏了某種試劑或某個(gè)步驟 詳細(xì)審閱說明書,并嚴(yán)格遵循操作步驟。

問題3:顯色淡

結(jié)果描述 可能的原因 建議或預(yù)防措施
包括標(biāo)曲、樣本在內(nèi)的所有板孔顏色均較淡 試劑盒超過有效期或儲(chǔ)存不當(dāng) 請(qǐng)?jiān)谟行趦?nèi)使用,并按照說明書推薦的保存條件保存,避免污染。
試劑、樣品用前未平衡 所有試劑、樣品應(yīng)置室溫平衡30min。
移液器吸量不足,移液抽吸排放太快,吸頭內(nèi)壁掛液太多或內(nèi)壁不清潔 校正移液器,吸頭要配套,每次吸頭要吻合緊密。移液不宜過快,排放應(yīng)完全。吸頭內(nèi)壁要清潔,最好一次性使用。
孵育反應(yīng)時(shí)間不足 定時(shí)器準(zhǔn)確定時(shí)。
顯色反應(yīng)時(shí)間不足 一般在15-30min,20min為佳,特殊除外。
顯色劑加入順序顛倒(雙組份) 請(qǐng)嚴(yán)格按說明書。
洗滌次數(shù)增加,濃縮洗液稀釋倍數(shù)不符合要求 減少洗滌沖擊力,按說明書要求稀釋濃縮洗液、洗滌時(shí)間,準(zhǔn)確記錄洗滌次數(shù)及用量。
蒸餾水水質(zhì)有問題 確保配制試劑所需蒸餾水無污染。
洗板及加樣過程中,酶標(biāo)物受污染失活而失去催化顯色劑顯色的能力 確認(rèn)配制洗液的容器已洗干凈、無污染。
標(biāo)曲正常,樣本顯色較淡 樣本使用NaN3防腐,抑制了酶的反應(yīng) 樣本樣本不可使用NaN3。
待測(cè)標(biāo)本中可能不含強(qiáng)陽性標(biāo)本,故結(jié)果可能是正常的 如有懷疑,可復(fù)檢。
目測(cè)結(jié)果正常,但酶標(biāo)儀讀值偏低 讀取吸光值時(shí)使用了錯(cuò)誤的濾光片 TMB為底物時(shí)應(yīng)在450nm波長(zhǎng)讀取吸光值,并以540nm或570nm作為校正波長(zhǎng)。

問題4:標(biāo)準(zhǔn)曲線不佳/重復(fù)性不好

結(jié)果描述 可能的原因 建議或預(yù)防措施
重復(fù)性差 標(biāo)準(zhǔn)品配制有誤 嚴(yán)格按照說明書標(biāo)準(zhǔn)品配制進(jìn)行操作。僅使用推薦的稀釋液對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行稀釋。
試劑盒儲(chǔ)存方法不當(dāng)或儲(chǔ)存環(huán)境太差 請(qǐng)?jiān)谡f明書推薦的保存條件下保存,不要將重懸后的組份在室溫放置時(shí)間過長(zhǎng)。
過早稀釋各工作組分 各工作組份請(qǐng)?jiān)谑褂们?0分鐘配制,并立即加入到微孔中。
樣本加入后未混勻 針對(duì)同時(shí)加入多種試劑組份,加樣后在混勻器上充分混勻。注意穩(wěn)拿穩(wěn)放,防止外濺。
酶標(biāo)儀測(cè)定重復(fù)性差 校準(zhǔn)酶標(biāo)儀。
孵育時(shí)間、洗滌條件、顯色條件、操作人員不一致 重復(fù)測(cè)定標(biāo)本,反應(yīng)條件、人員等盡可能與上次保持一致。
洗滌不正確 移液器準(zhǔn)確吸取所需洗液體積并注入孔內(nèi),切勿溢出。洗板機(jī)洗板時(shí)不應(yīng)有堵孔,洗滌應(yīng)充分。
孵育溫度恒溫效果不好 保證溫度恒定,避免局部溫度過高過低。
加液時(shí),過多殘留于孔壁上 加液時(shí),吸頭在不碰到孔底或孔壁的前提下盡量懸空加。
耗材重復(fù)使用 吸取不同的試劑時(shí)應(yīng)更換吸頭,配置不同的試劑組份時(shí),應(yīng)使用不同的儲(chǔ)液器皿。
微孔底部被劃傷或存在污垢 操作時(shí)細(xì)心,注意不要觸碰底部。擦拭酶標(biāo)板底部,以去除污垢或指紋。
定性檢測(cè)結(jié)果判定時(shí),閾值附近時(shí)陰時(shí)陽 同一樣品做3個(gè)復(fù)孔,以2個(gè)(含2個(gè))以上相同結(jié)果為準(zhǔn)。
加樣時(shí)交叉污染 加樣本時(shí)更換槍頭,避免交叉污染。
出現(xiàn)隨機(jī)性的花板、跳孔現(xiàn)象 拍板時(shí)交叉污染 拍板時(shí)用合適的吸水紙巾,不要把無關(guān)物質(zhì)拍進(jìn)板孔,并盡量不要在同一位置拍,以免交叉污染。
洗板機(jī)加液頭堵塞導(dǎo)致加液不滿或吸液殘留量較大,造成花板、跳孔 疏通洗板機(jī)加液頭。
樣本離心處理不全,致使反應(yīng)孔內(nèi)發(fā)生凝血現(xiàn)象或存在沉淀物或殘留細(xì)胞成分干擾 存放的樣本應(yīng)充分離心。
樣品放置時(shí)間過長(zhǎng),污染 樣品應(yīng)保持新鮮,或低溫保存,防止污染。
洗滌液配制有誤或直接誤用濃縮洗滌液 按說明書配制。