ELISA試劑盒技術(shù)原理及方法對(duì)比
1971年瑞典學(xué)者Engvail和Perlmann,荷蘭學(xué)者Van Weerman和Schuurs分別報(bào)道將免疫技術(shù)發(fā)展為檢測(cè)體液中微量物質(zhì)的固相免疫測(cè)定方法,即酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法 (ELISA) 。
1. ELISA技術(shù)原理
ELISA 是將抗原抗體的特異性免疫反應(yīng)與酶的催化反應(yīng)相結(jié)合的免疫檢測(cè)技術(shù),利用酶標(biāo)技術(shù)標(biāo)記抗原或抗體,通過(guò)顯色反應(yīng),用以檢測(cè)相應(yīng)的抗體或抗原,對(duì)其進(jìn)行定性或定量分析。
① 將已知的抗原或抗體通過(guò)物理吸附于固相載體表面,并保持其免疫學(xué)活性;
② 利用酶標(biāo)技術(shù)使抗原或抗體與酶形成酶結(jié)合物,并保持酶標(biāo)抗原或抗體的免疫活性及酶的活性;
③ 酶結(jié)合物與相應(yīng)的抗原或抗體結(jié)合后,加入底物,底物被酶催化顯色,依據(jù)底物顏色反應(yīng)及深淺判斷待測(cè)物中相應(yīng)抗體或抗原的量。
2. 三種必要的試劑
在這種測(cè)定方法中有3種必要的試劑:
① 固相的抗原或抗體(免疫吸附劑)
② 酶標(biāo)記的抗原或抗體(標(biāo)記物)
③ 酶作用的底物(顯色劑)
3. ELISA四種常用的方法
ELISA可用于測(cè)定抗體,也可用于檢測(cè)抗原。根據(jù)檢測(cè)目的和操作步驟不同,有四種類型的常用方法:間接法、雙抗體夾心法、雙抗原夾心法、競(jìng)爭(zhēng)法。
3.1 間接法(此法是測(cè)定抗體最常用的方法)
將已知抗原吸附于固相載體,加入待檢標(biāo)本(含相應(yīng)抗體)與之結(jié)合。洗滌后,加入酶標(biāo)抗球蛋白抗體(酶標(biāo)抗抗體)和底物進(jìn)行測(cè)定。
3.2 雙抗體夾心法(此法常用于測(cè)定抗原)
將已知抗體吸附于固相載體、加入待檢標(biāo)本(含相應(yīng)抗原)與之結(jié)合。溫育后洗滌,加入酶標(biāo)抗體和底物進(jìn)行測(cè)定。
3.3 雙抗原夾心法(此法多用于乙肝抗體檢測(cè))
將已知抗原吸附于固相載體、加入待檢標(biāo)本(含相應(yīng)抗體)與之結(jié)合。溫育后洗滌,加入酶標(biāo)抗原和底物進(jìn)行測(cè)定。
3.4 競(jìng)爭(zhēng)法(此法可用于抗原和半抗原的定量測(cè)定,也可用于測(cè)定抗體)
以測(cè)定抗原為例,將持異性抗體吸附于固相載體;加入待測(cè)抗原和一定量的酶標(biāo)已知抗原,使二者競(jìng)爭(zhēng)與固相抗體結(jié)合;經(jīng)過(guò)洗滌分離,最后結(jié)合于固相的酶標(biāo)抗原與待測(cè)抗原含量呈負(fù)相關(guān)。
4. ELISA四種方法的比較
方法 | 注意點(diǎn) | 優(yōu)勢(shì) | 缺點(diǎn) |
---|---|---|---|
間接法 Indirect ELISA |
關(guān)鍵是抗原的純度。也要注意正常血清中所含的高濃度的非特異性抗體這一干擾因素。 | 二抗可以加強(qiáng)信號(hào),而且有多種選擇能做不同的測(cè)定分析。不加酶標(biāo)記的一級(jí)抗體則能保留它最多的免疫反應(yīng)性。 | 交互反應(yīng)發(fā)生的機(jī)率較高。 |
雙抗體夾心法Sandwich ELISA | 兩種抗體必須小心選取,才可避免交互反應(yīng)或競(jìng)爭(zhēng)相同的抗原結(jié)合部位。 | 高靈敏、高專一性,抗原無(wú)須事先純化。 | 抗原一定得擁有兩個(gè)以上的抗體結(jié)合部位。 |
雙抗原夾心法Sandwich ELISA | 關(guān)鍵在于酶標(biāo)抗原的制備。根據(jù)抗原結(jié)構(gòu)的不同,尋找合適的標(biāo)記方法。 | 受檢標(biāo)本不需稀釋,可直接用于測(cè)定,因此其敏感度相對(duì)高于間接法。 | 只適用于某些項(xiàng)目,受抗原大小等很多因素影響。 |
競(jìng)爭(zhēng)法 Competitive ELISA |
這兩種抗體必須小心選取,才可避免交互反應(yīng)或競(jìng)爭(zhēng)相同的抗原結(jié)合部位。 | 可適用比較不純的樣本,而且數(shù)據(jù)再現(xiàn)性很高。 | 整體的敏感性和專一性都較差。 |